Chromatographie HPLC

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Bonjour,

Je regardais la chromatographie HPLC par curiosité parce que j’ai vu que c’était une méthode de purification sur un site. Pouvez-vous déjà me confirmer que c’est une méthode de purification et pas seulement de séparation (sauf si les deux sont liés) ?

J’ai regardé le principe et de ce que j’ai compris on a comme dans les CCM une phase stationnaire qui est ici composée de petites billes de C18 (c’est quoi / pourquoi ?) et une phase mobile qui est ce qu’on veut séparer comme par exemple des parabènes avec un solvant. Dans le doc que je regardais, ils mentionnaient que plus les billes sont petites, meilleure sera la résolution au final. Je suis pas sûr de comprendre pourquoi et même pourquoi on utilise des billes.

Sinon, dernière question, comment est composé le détecteur et pourquoi on a besoin d’une très haute pression? :D

Merci!

Les 2 sont lies. Basiquement, un purification, c’est séparer ce qui t’intéresse et le reste. Tout dépend comment tu vas "sélectionner" spécifiquement ce qui t’intéresse.

Pour le C18, ce sont des polymères de CH2 (donc C18 = 18 CH2). En gros, une longue chaîne de carbones, cf http://www.chemspider.com/Chemical-Structure.11145.html. Plus generalement, l’HPLC C18 est une phase inverse (cf https://fr.wikipedia.org/wiki/Chromatographie_en_phase_inverse ), les molecules sont retenues selon leur affinite avec la phase stationnaire : si la molecule a plus d’affinite pour la phase stationnaire que la phase mobile, elle s’accroche. Si c’est l’inverse, elle migre.

Pour les billes, il y a 2 effets : la surface totale des billes qui augmente (pour un volume donné) quand la taille des billes diminuent. Et le volume mort dans les billes quand les billes sont poreuses. Par contre, plus les billes sont petites, plus la pression doit etre élevée, et donc plus c’est cher. C’est en gros ce qui distingue la LC, l’HPLC, la nano-HPLC.

Pour la détection, tout dépend de ce que tu veux détecter. Ca peut aller d’un simple détecteur UV a un spectromètre de masse.

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Purification

Les méthodes dîtes de purifications, par les puristes sont les méthodes "naturelles" :

  • Sublimation
  • Distillation
  • Cristallisation

Et j’en oublie surement. Les chromatographie font parties des méthodes séparatives. Bien souvent, par abus de langage on dira "technique de purification" pour parler de chromatographie… Mais c’est un abus.

Pourquoi donc en est-ce un ?

Et bien j’ai remarqué et c’est ce qu’on m’a donné pour explication : qu’un spectre RMN d’un produit distillé, comparé à un spectre RMN d’un produit séparé par chromatographie préparative, est horriblement propre. On utilise generalement des solvant de pureté 95% pas mieux dans ce cas-ci, et donc on se tape des impuretés de solvant/stabilisateur du plastique de la bouteille sui se retrouve solubilisé dans le solvant. Alors qu’issus d’une recristallisation ou d’un distillation le spectre est quasiment un "spectre RMN de référence" tellement les pics sont beau, là où ils doivent-être etc…

Préparation

Maintenant il faut faire la différence entre :

  • Chromatographie analytique
  • Chromatographie préparative

Dans la première nous avons les $CCM$, les chromato ionique, les $HPLC$,les $CPG$ voir même les $UPLC$. Ce sont des méthodes d’analyses. On obtiens ce qu’on appelle un chromatogramme qui recense les composés trouvé au seins du mélange. Et pour bien faire le travail cela demande d’avoir déjà une idée de ce qu’il y a dedans, et d’avoir réussi à étalonner l’appareil avant la mesure histoire d’obtenir un aspect quantitatif quasi parfait. La qualités des solvant ici doit être spécifiquement $\mathrm{HPLC\;GRADE}$, dit ’de qualité HPLC’, $99\%$

Dans la seconde tranche de chromatographie que l’on rencontre on est plus sur de la chimie organique/supramoléculaire où l’on cherche à obtenir un produit +/- pur pour en faire quelque chose, typiquement le ré-engager dans une nouvelle réaction :

réaction 1
$$\mathrm{ A + B \rightarrow C + Impuretés }$$
séparation 1
$$\mathrm{ C + Impuretés \rightarrow C }$$
réaction 2
$$\mathrm{ C + D \rightarrow E + Impuretés }$$

Pourquoi une grosse pression ? Imagine une colonne qui est appelé "colonne capillaire", ça veut dire que la section interne est extrêmement petite, un cheveux. Et qu’en plus de ça tu a garnie de silice collé aux parois ce même capillaire ?

Comment diable arrives tu a faire passer un solvant la dedans sans au moins 200 Bar ?

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